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  HAD-V5YX 分光光度計原理操作方法

原理

分光光度計采用個可以產(chǎn)生多個波長的光源，通過系列分光裝置，從而產(chǎn)生特定波長的光源，光線透過測試的樣品后，分光線被吸收，計算樣品的吸光值，從而轉(zhuǎn)化成樣品的濃度。樣品的吸光值與樣品的濃度成正比。

單色光輻射穿過被測物質(zhì)溶液時，被該物質(zhì)吸收的量與該物質(zhì)的濃度和液層的厚度（光路長度）成正比，其關(guān)系如下式：

A=-lg(I/I0)=-lgT=kLc

式中 :A 為吸光度；

I0為入射的單色光強度；

I 為透射的單色光強度；

T 為物質(zhì)的透射率；

k 為摩爾吸收系數(shù)；

L 為被分析物質(zhì)的光程，即比色皿的邊長；

c 為物質(zhì)的濃度；

蛋白質(zhì)的直接定量（UV法）

這種方法是在280nm波長，直接測試蛋白。選擇Warburg 公式，光度計可以直接顯示出樣品的濃度，或者是選擇相應(yīng)的換算方法，將吸光值轉(zhuǎn)換為樣品濃度。蛋白質(zhì)測定過程非常簡單，測試空白液，然后直接測試蛋白質(zhì)。由于緩沖液中存在些雜質(zhì)，般要消除320nm 的“背景"信息，設(shè)定此能“開"。與測試核酸類似，要求A280的吸光值至少大于0.1A，佳的線性范圍在1.0-1.5 之間。實驗中選擇Warburg 公式顯示樣品濃度時，發(fā)現(xiàn)讀數(shù)“漂移"。這是個正常的現(xiàn)象。事實上，只要觀察A280的吸光值的變化范圍不過1%，表明結(jié)果非常穩(wěn)定。漂移的原因是因為Warburg 公式吸光值換算成濃度，乘以定的系數(shù)，只要吸光值有少許改變，濃度就會被放大，從而顯得結(jié)果很不穩(wěn)定。蛋白質(zhì)直接定量方法，適合測試較純凈、成分相對單的蛋白質(zhì)。紫外直接定量法相對于比色法來說，速度快，操作簡單；但是容易受到平行物質(zhì)的干擾，如DNA的干擾；另外敏感度低，要求蛋白的濃度較。

比色法蛋白質(zhì)定量

蛋白質(zhì)通常是多種蛋白質(zhì)的混合物，比色法測定的基礎(chǔ)是蛋白質(zhì)構(gòu)成成分：氨基酸（如酪氨酸，絲氨酸）與外加的顯色基團或者染料反應(yīng)，產(chǎn)生有色物質(zhì)。有色物質(zhì)的濃度與蛋白質(zhì)反應(yīng)的氨基酸數(shù)目直接相關(guān)，從而反應(yīng)蛋白質(zhì)濃度。

比色方法

般有BCA，Bradford，Lowry 等幾種方法。

Lowry 法：以早期的Biuret 反應(yīng)為基礎(chǔ)，并有所改。蛋白質(zhì)與Cu2 反應(yīng)，產(chǎn)生藍色的反應(yīng)物。但是與Biuret 相比，Lowry 法敏感性更。缺點是需要順序加入幾種不同的反應(yīng)試劑；反應(yīng)需要的時間較長；容易受到非蛋白物質(zhì)的影響；含EDTA，Triton x-100，ammonia sulfate 等物質(zhì)的蛋白不適合此種方法。

BCA（Bicinchoninine　acid　assay）法：這是種較新的、更敏感的蛋白測試法。要分析的蛋白在堿性溶液里與Cu2 反應(yīng)產(chǎn)生Cu ，后者與BCA形成螯合物，形成紫色化合物，吸收峰在562nm波長。此化合物與蛋白濃度的線性關(guān)系較強，反應(yīng)后形成的化合物非常穩(wěn)定。相對于Lowry法，操作簡單，敏感度。但是與Lowry法相似的是容易受到蛋白質(zhì)之間以及去污劑的干擾。

操作方法

1.接通電源，打開儀器開關(guān)，掀開樣品室暗箱蓋，預(yù)熱10分鐘。

2.將靈敏度開關(guān)調(diào)至“1"檔（若零點調(diào)節(jié)器調(diào)不到“0"時，需選用較。）

3.根據(jù)所需波長轉(zhuǎn)動波長選擇鈕。

4.將空白液及測定液分別倒入比色杯3/4處，用擦鏡紙擦清外壁，放入樣品室內(nèi)，使空白管對準(zhǔn)光路。

5.在暗箱蓋開啟狀態(tài)下調(diào)節(jié)零點調(diào)節(jié)器，使讀數(shù)盤針向t=0處。

6.蓋上暗箱蓋，調(diào)節(jié)“100"調(diào)節(jié)器，使空白管的t=100，針穩(wěn)定后逐步拉出樣品滑竿，分別讀出測定管的光密度值，并記錄。

7.比色畢，關(guān)上電源，取出比色皿洗凈，樣品室用軟布或軟紙擦凈。